抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測試劑盒(PNP 微板法)的產(chǎn)品介紹

產(chǎn)品簡介：

酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布極廣泛，遍布各種組織，主要存在于細胞的溶酶體內(nèi)，所以常作為溶酶體標志酶。溶酶體外的酸性磷酸酶存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)內(nèi)，各種動物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的適宜 pH 值為 4.5～5.5；存在于正常人肺泡巨噬細胞和白血病人脾臟的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)

均在細胞濾泡中，并不是釋放入血液，血液中的 TRAP 絕大多數(shù)來源于破骨細胞，因此可以通過測量血液中的 TRAP 了解破骨細胞的功能狀態(tài)，幾乎被認為是是機體破骨活性的唯一血液指標，TRAP 是一種糖基化的含金屬蛋白酶，在破骨細胞(osteoclast)和破軟骨細胞

(chondroclast)中高表達，在活化的巨噬細胞和神經(jīng)元中也有表達。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測試劑盒(PNP 微板法)(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)檢測原理是利用 p-nitrophenyl phosphate (pNPP) 為一種常用的磷酸酶顯色底物，在酸性 條件下可在 ACP 的作用下生成 p-nitrophenol (p-NP)；在堿性條件下 p-NP 呈黃色，黃色越深說明 ACP 活性越高，反之則酶活性越低，在 400～415nm 處有最大吸收；在適量的酒石酸存在的情況下進行 ACP活性檢測，得到的 ACP 活性就是 TRAP 的活性，根據(jù) p-NP 的生成量即可計算出 TRAP 的活性水平，可用于檢測細胞或組織的裂解液或勻漿液、血漿、血清、尿液等樣品中內(nèi)源性的TRAP 活性。該試劑盒僅用于科研領域，不適用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

1、準備樣品：

①血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定，尿液通常也可以直接用于測定，-20℃凍存，用于 TRAP 的檢測。

②細胞或組織樣品：取恰當細胞或組織裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理鹽水進行適當勻漿，一般細胞數(shù)量在 106 以上，組織應在 100mg 以上，3000~4000g 離心取上清， -20℃凍存，用于 TRAP 的檢測。

③植物樣品： 取適量的植物組織加入少量 PBS 或生理鹽水， 充分搗碎或研磨，靜置 30min，用紗布或濾紙過濾，4000g 離心 20min，留取上清液并測量體積，-20℃凍存，

用于 TRAP 的檢測。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的 TRAP，可以使用 ACP Assay Buffer、PBS

或生理鹽水稀釋后再行檢測。

2、配制顯色工作液： 取出 1 支 pNPP，恢復至室溫后溶解于 2.5ml ACP Assay Buffer，

混勻，冰上預冷備用，新配制的顯色工作液應在 6h 內(nèi)用完。

3、配制系列標準品：取出 p-nitrophenol(10mM)恢復至室溫，離心機 10000rpm 離心 5min，按p-nitrophenol(10mM)：ACP Assay Buffer=1：19的比例混合，使?jié)舛冗_到0.5mM，-20℃凍存?zhèn)溆�；按下表繼續(xù)稀釋：

5、TRAP 測定：輕輕混勻，37℃孵育 25～30min，每孔加入 160μl Stopping Solution

終止反應；以空白調(diào)零，酶標儀測定 405nm 處標準管、測定管的吸光度。

計算：

系列標準品(1~6 號)濃度(即 p-NP 含量)0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02

μM 為橫坐標，以對應的標準孔吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)測定孔的吸光度在標準曲線上查得待測樣品 p-NP 的生成量。酸性磷酸酶活性單位的定義：在 pH 值 4.8 37℃條件下，每分鐘水解 pNPP 顯色底物產(chǎn)生 1 μM p-NP 所需的酸性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，根據(jù)酶活性定義，計算出樣品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。TRAP 酶活性(μM/min)=待測樣品 p-NP 生成量/孵育時間

注意事項：

1、待測樣品中不能含有磷酸酶抑制劑，同時需避免反復凍融。

2、如果待測樣品體積較少，可減少樣品加樣量，以 ACP Assay Buffer 補至 30μl。

3、如果無法檢測 405nm，亦可檢測 400～415nm 范圍內(nèi)吸光度。

4、建議每次測定時都最好作標準曲線，以使標準更準確，另外標準品避免反復凍融。

5、如果沒有酶標儀，也可以使用普通的分光光度計測定，但應考慮根據(jù)比色杯的最小檢測

體積，盡量采用小體積的比色杯。

6、所測樣品的含量高于標準曲線的上限，應用 ACP Assay Buffer 稀釋樣品后重新測定。

7、配制 1 支顯色工作液后應當日用完，因此請注意適當多準備一些樣品一起檢測。

8、p-nitrophenol 溶液對人體有害，反應終止液有腐蝕性，請小心操作。

9、如果希望進行酶活性的絕對定量，進行酶反應時應精確計時，此時推薦采用孵育 30min或更長時間，以減小操作過程中的時間誤差。

10、待測樣品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性較低時，可適當延長孵育時間至 30min。

有效期：12 個月有效；4℃運輸，-20℃保存。

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