木聚糖酶檢測試劑盒(DNS 微板法)的計算

產(chǎn)品簡介：

木聚糖(Xylan)是植物細胞壁的主要組成成分，它也是可利用的豐富的半纖維素。木聚糖酶(Xylanase)指能專一降解半纖維素、木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱。木聚糖酶主要來源于細菌和真菌，包括厭氧菌、需氧菌、嗜溫微生物、嗜熱微生物和極端微生物等。

木聚糖酶主要包括 3 類：①β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)，從木聚糖主鏈的內(nèi)部切割β-1，4 糖苷鍵，使木聚糖溶液的黏度迅速降低；②β-1,4-D-外切木聚糖酶(EC3.2.1.92)，以單個木糖為切割單位，作用于木聚糖的非還原性末端，使反應(yīng)體系還原性不斷增加；③β

-木糖苷酶(EC3.2.1.37)，切割低聚木糖，水解產(chǎn)物主要為木糖、木二糖及木三糖等低聚木糖。

根據(jù)酶的理化特性，木聚糖酶又可分為 2 大類：即分子量小于 30ku 的堿性木聚糖酶和

分子量大于 30ku 的酸性木聚糖酶。通常細菌可以同時產(chǎn)生酸、堿性木聚糖酶，但真菌通常只產(chǎn)生低分子量的堿性木聚糖酶。從本質(zhì)上講，木聚糖酶都具有外切酶和內(nèi)切酶活性，只是活性高低不同而已。作為一種工業(yè)用酶制劑，木聚糖酶具有潛在的應(yīng)用價值。首先木聚糖酶可以將農(nóng)業(yè)和木材工業(yè)的廢物中的木聚糖轉(zhuǎn)化為木糖；其次，Wong 等建議木聚糖酶可應(yīng)用在果汁澄清、咖啡、植物油和淀粉提取加工過程中。木聚糖酶檢測試劑盒(DNS 微板法)檢測原理是：木聚糖酶能將木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下可以與３,５-二硝基水楊酸(DNS)試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)液顏色的深度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通過測定反應(yīng)液顏色的強度，可以計算反應(yīng)液中木聚糖酶的活力。本產(chǎn)品僅用于科研領(lǐng)域，不用于臨床診斷或其他用途。

自備材料：

1、去離子水或蒸餾水

2、電子天平(精度 0.0001g)、pH 計、磁力攪拌器、移液器、小燒杯

3、振蕩器、紗布、離心機、離心管或試管、三角瓶、容量瓶、

4、水浴鍋、電熱爐、培養(yǎng)箱、酶標儀、酶標板

操作步驟(僅供參考)：

1、配制木聚糖溶液：準確稱取 0.15g 木聚糖，使充分溶解于 8ml 去離子和 5ml NH 水溶液(3×)中，通過 pH 計測定，用 YS 溶液調(diào)節(jié) pH 至 5.5~5.6，補水至 15ml，木聚糖終濃度為 10mg/ml，4℃避光保存，48 小時有效。

2、配制 NH 水溶液(1×)：取 1 份 NH 水溶液(3×)和 2 份去離子水混合即成。

3、標準曲線繪制：取8支離心管按下表設(shè)置，準確吸取木糖標準(10mg/ml)與Assay buffer，

即得不同濃度的木糖梯度標準。

4、準備樣品:

①固體樣品按照下表中建議的稱樣量稱取試樣兩份，精確至 0.001 g。 加入 4ml Assay

buffer，充分溶解，并定容至 10 ml，在 4 °C 條件下避光保存 1~2h。1000g 離心 3~5min，取上清液，再用 Assay buffer 做適當稀釋、定容(稀釋后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制在 0.04~0.10U/ml 之間）。

②液體樣品可以直接用 Assay buffer 稀釋、定容(稀釋后的酶液中木聚糖酶活力最好能控

制在 0.04~0.10 U/ml 之間）。如果樣品稀釋后酶液的 pH 偏離 5.4~5.7，需要用乙酸溶

液或氫氧化鈉溶液校正至 5.4~5.7。

5、測定樣品

①取適量的木聚糖溶液和酶提取液置于不同的離心管中，37°C 平衡 20 min；木聚糖溶

液使用之前應(yīng)充分搖勻。

②取 2 支離心管按下表設(shè)置依次加入相應(yīng)試劑：

計算：

木聚糖酶活力單位定義：在 37℃ pH5.5 的條件下，每分鐘從濃度為 5mg/ml 的木聚

糖溶液中降解釋放１μmol 還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位Ｕ。根據(jù)酶活性定義，可

計算出樣品中的木聚糖酶活性。

以系列木糖標準(mg/ml) (1~7 號)為橫坐標，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

根據(jù)標準曲線計算出酶提取液(對照管和測定管)的吸光度相對應(yīng)的木糖濃度 C，根據(jù)下式再

計算木聚糖酶活性。

D1= N×(C1-C0)×1000/(1×M×t)=N×(C1-C0)×1000/4506

D2=D1×V0/m

式中：D1——稀釋酶液中木聚糖酶的活力，單位為 U/ml

N——樣品稀釋倍數(shù)

C1——樣品測定管木糖濃度，單位為 mg/ml

C0——樣品對照管木糖濃度，單位為 mg/ml

1000——轉(zhuǎn)換因子，1mmol=1000μmol

M——木糖的摩爾質(zhì)量，單位為 g/mol（=150.2）

t——酶與底物的反應(yīng)時間，單位為 min（=30）

D2——固體樣品中木聚糖酶的活力，單位為 U/g

V0——固體樣品的酶提取液總體積，單位為 ml

m——稱取樣品的質(zhì)量，單位為 g

注意事項：

1、 木糖標準應(yīng)避免反復凍融，以免失效或效率下降。

2、 木聚糖易溶于堿性溶液中，加入 YS 溶液后呈懸濁狀，靜置后可能分層，為減少實驗誤差，后續(xù)實驗使用時應(yīng)搖勻。

3、 待測酶提取液樣品如不能及時測定，應(yīng)置于-20℃保存，3 天內(nèi)穩(wěn)定。

4、 如果樣品酶活性過高，應(yīng)用 Assay buffe 稀釋酶提取液后重測，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

5、 木聚糖酶的最適 pH 一般在 5.5。如果樣品稀釋后酶液的 pH 偏離 5.4~5.7，需要用乙酸溶液或氫氧化鈉溶液校正至 5.4~5.7。

6、 本試劑盒適用于飼料等樣品的木聚糖酶活性的測定。

7、 Assay buffer 如不夠用，可用乙酸鈉緩沖液(0.1mol/L,pH5.5-6.0)替代。

8、 DNS 試劑、NH 水溶液(2×) 和 YS 溶液有一定的腐蝕性和刺激性，應(yīng)小心操作。

9、 沸水浴實驗操作時，應(yīng)當選擇帶螺旋蓋的離心管。

10、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個月有效。低溫運輸，按要求保存。

 木聚糖酶檢測試劑盒(DNS 微板法)的計算