脯氨酸(PRO)檢測(cè)試劑盒(茚三酮微板法)的用途

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

脯氨酸(Proline，Pro)是一種環(huán)狀的α-亞氨基酸，呈中性，等電點(diǎn)為 6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，25℃時(shí) 100g 水中可溶 162g 左右，易潮解不易得結(jié)晶，有甜味。脯氨酸與茚三酮溶液共熱，生成黃色化合物，一旦進(jìn)入肽鏈后，可發(fā)生羥基化作用，從而形 4-羥脯氨酸，是組成動(dòng)物膠原蛋白的重要成分，羥脯氨酸也存在于多種植物蛋白質(zhì)中，尤其與細(xì)胞壁的形成有關(guān)，在正常情況下脯氨酸含量較低，但在逆境下(旱、熱、冷、凍、鹽堿等)，常有脯氨酸的明顯積累，即積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，在臨床、生物材料、工業(yè)等方面均有廣泛應(yīng)用。脯氨酸(PRO)檢測(cè)試劑盒(茚三酮微板法)檢測(cè)原理是脯氨酸游離于磺基水楊酸溶液中，前者與酸性茚三酮共熱發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的紅色產(chǎn)物，以酶標(biāo)儀測(cè)定 520nm處吸光度值，在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與脯氨酸濃度成正比。該試劑盒主要用于測(cè)定植物組織中的游離脯氨酸含量，僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。 

操作步驟(僅供參考)：

1、配制 PRO Lysis buffer(1×)：取 1 份 PRO Lysisbuffer(5×)加 4 份去離子水混勻即成。

2、配制茚三酮顯色液: 準(zhǔn)確稱取 0.75g 茚三酮，溶解于 30ml 茚三酮稀釋液中，70℃加熱攪拌至完全溶解(也可用超聲助溶)，混勻，即為茚三酮顯色液。4℃避光備用，48h 有效。

注意：茚三酮稀釋液具有一定腐蝕性，請(qǐng)小心操作。如果 2 天內(nèi)用不完，可以稱取一定量的茚三酮，加入茚三酮稀釋液使終濃度為 2.5%即可。

3、準(zhǔn)備樣品：

①植物樣品：取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，切碎，迅速稱取 0.5g，加入 5ml PROLysis buffer(1×)后勻漿或研磨，沸水浴 10min(期間經(jīng)常搖動(dòng))，混勻，用濾紙或紗布過(guò)濾，濾液即為脯氨酸提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/font>

②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，-20℃凍存，用于脯氨酸的檢測(cè)。

③細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如有必要用 PRO Lysis buffer(1×)進(jìn)行適當(dāng)勻漿，留取上清即脯氨酸提取液，用于脯氨酸的檢測(cè)。4℃保存?zhèn)溆茫? 天有效。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高濃度的脯氨酸，可以使用 PRO Lysis buffer(1×)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

4、配制系列脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：取出脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)(100μg/ml)恢復(fù)至室溫后，用去離子水稀釋為脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)(10μg/ml)。

5、PRO 加樣：按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的脯氨酸濃度過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置平行管。

6、PRO 測(cè)定：迅速冷卻加入 0.6~0.9ml 甲苯或二甲苯，振搖 30s，靜置片刻，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管或試管，3000r/min 離心 10min，取上清液 200μl 分別加至 96 孔板中，空白管調(diào)零，520nm 處用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光度。注：加入甲苯或二甲苯的量前后應(yīng)統(tǒng)一；空白管和標(biāo)準(zhǔn)管不用離心，可直接取上清液測(cè)定。

計(jì)算：以系列脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)(1~7 號(hào))濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定管的吸光度進(jìn)而計(jì)算其脯氨酸濃度。根據(jù)如下公式計(jì)算具體樣品中脯氨酸的含量：

植物組織樣品 PRO(μg/g)=C×VT/W

式中：C=從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸濃度(μg/ml)

VT=脯氨酸提取液總體積(ml)

W=樣品鮮重(g)

血清、尿液等樣品 PRO (μg/ml)=C×N

式中：C=從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸濃度(μg/ml)

N=稀釋倍數(shù)

注意事項(xiàng)：

1、 實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)盡量新鮮，如取材后不立即使用，應(yīng)存于 4℃。

2、 PRO Assay buffer 應(yīng)密閉保存，防止揮發(fā)。

3、 PRO Lysis buffer(5×)、PRO Assay buffer 和茚三酮稀釋液都有一定腐蝕性，應(yīng)小心操作。

4、 茚三酮顯色液配制后可 4℃避光保存 48h 有效。建議盡快使用或用多少配多少。

5、 本檢測(cè)方法，資料中大多建議使用甲苯進(jìn)行抽提反應(yīng)后的紅色色素，因甲苯管制或不易獲得，經(jīng)我公司對(duì)比實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲苯可有效替代甲苯進(jìn)行抽提。

6、 因甲苯或二甲苯都有一定危害性，使用時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中小心抽取，用后應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋，防止揮發(fā)。

7、 如果沒(méi)有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮分光光度計(jì)的最小檢測(cè)體積。

8、 測(cè)定時(shí)不能使用塑料的酶標(biāo)條或比色皿，因甲苯或二甲苯等有機(jī)溶劑與其反應(yīng)，使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

9、 所測(cè)樣本的脯氨酸濃度過(guò)高，應(yīng)用 PRO Lysis buffer(1×)稀釋樣品后重新測(cè)定。

10、 沸水浴的反應(yīng)過(guò)程中，應(yīng)使用密封性能好的帶螺旋蓋子的離心管，防止因密封性不好而導(dǎo)致水分進(jìn)入；不宜使用扣蓋離心管，避免因爆沸使得蓋子崩開(kāi)而導(dǎo)致水分進(jìn)入；此二種原因都可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)。

11、 沸水浴的反應(yīng)過(guò)程中，人員不應(yīng)隨意接近，防止液體噴出，導(dǎo)致傷人事故的發(fā)生。

12、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個(gè)月有效。4℃運(yùn)輸，4℃保存。

脯氨酸(PRO)檢測(cè)試劑盒(茚三酮微板法)的用途