乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(二硝基苯肼微板法)的產(chǎn)品介紹

產(chǎn)品簡介：

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH 或 LD)屬于氧化還原酶，能夠催化氫氧原子或電子從一種底物轉(zhuǎn)移到另一種底物上乳酸脫氫酶是糖酵解和糖異生的一個極其重要的酶，含有鋅離子，廣泛分布于人和動物組織、植物和微生物，能可逆的催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之間的氧化還原反應(yīng)；其反應(yīng)公式：乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+，其中：L→P為正向反應(yīng)；P→L 為逆向反應(yīng)。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(二硝基苯肼微板法)其檢測原理是以 NAD 為受氫體，乳酸脫氫酶催化乳酸脫氫生成丙酮酸，丙酮酸與二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度呈正比，酶標(biāo)儀檢測440nm 處吸光度，通過測得的丙酮酸含量計算酶的活性，該方法的優(yōu)點(diǎn)是：1、試劑原料容易獲得；2、較為經(jīng)典的方法；3、適用于手工操作。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。 

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品：

①血漿、血清樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備，10 倍稀釋后可以用于該試劑盒的測定，室溫保存 3 天，用于 LDH 的檢測。

②細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行勻漿，低速離心取上清，室溫保存 3 天，用于 LDH 的檢測。

③長期保存樣品：如果提取后的樣品無法及時檢測，需要放置時間較長，按下列方法操作：取 LDH 保護(hù)劑 1 支，加入 1ml 的 LDH 保護(hù)稀釋液，配制成 LDH 保護(hù)工作液，-20℃避光保存；按待測樣品(如血清)：LDH 保護(hù)工作液=9:1 的比例混合，4℃避光保存。

④(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的 LDH 含量。

2、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：用 LDH Assay Buffer 準(zhǔn)確稀釋丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(5mmol/L)至 0.5 mmol/L，按下表稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)品。

3、配制堿性顯色工作液：按堿性顯色液：蒸餾水=2:3 的比例混合，即為堿性顯色工作液。

4、LDH 酶促：按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)孔、對照孔、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡；如果樣品中酶活性過高，可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再行測定。

5、LDH 測定：混勻，室溫放置 5min，酶標(biāo)儀 440nm 處測定各孔吸光度(記為 A 空白、A 標(biāo)準(zhǔn)、A 對照、A 測定)。

計算：LDH 活性單位的定義：以 100ml 血清，在 37℃孵育 15min，LDH 催化底物產(chǎn)生 1μmol 丙酮酸為一個金氏酶活力單位；根據(jù)酶活性定義，計算出樣品中的 LDH 活性。

以丙酮酸濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo)，以(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)吸光度之差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用(A 測定-A 對照)吸光度之差值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測樣品產(chǎn)生的丙酮酸濃度(μmol/L) ，按下述公式進(jìn)行計算：

其中： A 標(biāo)準(zhǔn)=標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度

A 空白=空白孔的吸光度

A 測定=測定孔的吸光度

A 對照=對照孔的吸光度

注意：如果待測樣品加入 LDH 保護(hù)工作液，其結(jié)果應(yīng)除以 0.9。

注意事項：

1、 血清或肝素抗凝血漿檢測效果較好，草酸鹽、EDTA 抗凝劑對 LDH 活性有抑制作用。

2、 避免使用溶血樣本。處理后的樣品應(yīng)及時檢測，否則易失效。

3、 LD4 和 LD5 對冷不穩(wěn)定，提取出來的血清樣本，不宜冰箱放置，室溫放置 2~3 天有效。

4、 比色應(yīng)在 3~15min 內(nèi)完成，否則吸光度會下降。

5、 酶促反應(yīng)中，組織勻漿液取樣量為 5~30ul，應(yīng)相應(yīng)增加空白和標(biāo)準(zhǔn)中蒸餾水的用量。

6、 如果樣品中酶活性過高，可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再行測定。

7、 堿性顯色液有一定腐蝕性，請小心操作。

8、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個月有效。

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