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輔酶 I NAD(H)測定試劑盒NAD + 的提取
發(fā)布時間:2023/12/12 9:15:30 已瀏覽次數(shù): 245 次

 輔酶 I NAD(H)測定試劑盒NAD + 的提取

(分光光度法,50T/24 樣)

一、 測定意義:

輔酶 I NAD(H) 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞

中,NAD + 是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要

氫受體,生成的 NADH 經(jīng)電子傳遞鏈(又稱呼吸鏈,ETC

傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時,形成大量的活性

氧(ROS),同時 NADH 再生為 NAD +。糖、脂、蛋白質(zhì)三

大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完

成。NAD(H)含量及 NADH/NAD +比值的高低可用于評價糖酵

解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H) NADH/NAD +比值說

明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外 NADH/NAD +

比值升高液可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外,NAD +降解產(chǎn)

物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作

用。

二、 測定原理:

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD + NADHNADH

通過 PMS 的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲䐶

Formazan),在 570nm 下檢測吸光值;而 NAD + 可被乙

醇脫氫酶還原為 NADH,進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測。

三、 需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、移液器、1mL 比色皿、研

缽、冰和蒸餾水

五、 NAD + NADH 提取:

1. 血清(漿)中 NAD + NADH 的提取

NAD + 的提。按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體

積(mL)為15-10 的比例(建議取約0.1mL 血清(漿),

加入1mL 酸性提取液),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);

冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取上清液至另一新

的離心管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,

10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提。按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體

積(mL)為15-10 的比例(建議取約0.1mL 血清(漿),

加入1mL 堿性提取液),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);

冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取上清液至另一新

的離心管中,加入等體積的酸性提取液使之中和,混勻,

10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

2.

組織中 NAD + NADH 的提取

NAD + 的提。按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL

15-10 的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL 酸性提取

液),冰浴研磨,煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰

浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取上清液至另一新的

離心管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,

10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL

15-10 的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL 堿性提取

液),冰浴研磨,煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰

浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取上清液至另一新的

離心管中,加入等體積的酸性提取液使之中和,混勻,

10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

3.

細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD + NADH 的提取

NAD + 的提。先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按

照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(10 4 個):酸性提取液體積(mL)為

500-10001 的比例(建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL

性提取液),超聲波破碎1min(冰浴,強(qiáng)度20%或200W

超聲2s,停1s),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰

浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取上清液至另一新的

離心管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,

10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提。先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,

按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(10 4 個):堿性提取液體積(mL)為

500-10001 的比例(建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL

性提取液),超聲波破碎1min(冰浴,強(qiáng)度20%或200W

超聲2s,停1s),煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失);冰

浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心10min;取上清液至另一新的

離心管中,加入等體積的酸性提取液使之中和,混勻,

10000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測。

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