二糖酶測試盒的酶促反應(yīng)

(測麥芽糖酶)

一、測定原理：

麥芽糖酶（Lactase）作用于相應(yīng)的底物產(chǎn)生單糖，

該單糖在其氧化酶的作用下產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫同

顯色劑結(jié)合產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物，用分光光度計測定其光密

度值，從而測定出麥芽糖酶的活性。

二、試劑的組成和配制（25T～100T）：

試劑一：粉劑×1 瓶，10mL 稀釋液×1 瓶，無色透明液體；

2～8℃保存。

底物的配制：在試劑一粉劑中加入 10mL 的稀釋液，充

分溶解后，備用；2～8℃保存。

試劑二：終止劑 5mL×1 瓶，2～8℃保存。

試劑三：50mL 液體×1 瓶，2～8℃保存。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：5.55mmol/L，液體，2～8℃保存。用時

按體積比 1:2 的比例加蒸餾水稀釋成

1.85mmol/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

三、操作表：

1、樣本處理:

①、液體樣本：直接測定，如超過線性范圍用生理鹽

水稀釋后測定。

②、組織樣本：準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g)：體積

(mL)=1：9 的比例，加入 9 倍體積的勻漿介質(zhì)，

冰水浴條件下機(jī)械勻漿,2500 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘，

取上清液待測。[注]:勻漿介質(zhì)可用磷酸鹽緩沖液

(0.1mol/L pH 7.4)或生理鹽水（0.9%）；

③、細(xì)胞樣本：

A、細(xì)胞收集:將制備好的細(xì)胞懸液取出，1000

轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，棄上清液，留細(xì)胞沉淀；

用等滲緩沖液（推薦 0.1mol/L 、pH7～7.4 磷

酸鹽緩沖液）清洗 1～2 次，同樣 1000 轉(zhuǎn)/分，

離心 10 分鐘，棄上清液，留細(xì)胞沉淀；

B、細(xì)胞破碎:加入 0.2～0.3mL 的勻漿介質(zhì)（推

薦 0.1mol/L pH7～7.4 磷酸鹽緩沖液或生理

鹽水）進(jìn)行勻漿，冰水浴條件下超聲破碎(功

率:300W,3～5 秒/次,間隔 30 秒，重復(fù) 3～5

次)或手動勻漿，制備好的勻漿液不離心直接

測 定 。 也 可 采 用 裂 解 液 裂 解 ( 推 薦

TritonX-100，1～2%,裂解 30～40 分鐘),裂解

好的液體不離心直接測定。[注]：建議細(xì)胞密

度在 100 萬個/mL 以上。破碎好的液體可顯

微鏡觀察細(xì)胞是否破碎完全。

2、酶促反應(yīng)：（可用離心管操作）

[注]：在做正式實驗前，先要取個別樣本（可以挑選正常組一

個和模型組一個）進(jìn)行濃度梯度預(yù)試（稀釋倍數(shù)可選 5

倍、10 倍、20 倍或其它），以確定最佳取樣濃度（最佳

濃度時，測定 OD－對照 OD 接近標(biāo)準(zhǔn) OD 即可；當(dāng)然，

樣本本身酶活力偏低時，直接原液測定甚至可以加大酶

促反應(yīng)取樣量或延長酶促反應(yīng)時間）。

四、計算公式：

1、液體樣本計算：

單位定義：在 37℃ PH6.0 的條件下，每毫升樣本每分鐘

水解 1nmol 麥芽糖定義為 1 個酶活力單位。

計算公式：

 二糖酶測試盒的酶促反應(yīng)