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二糖酶測試盒的酶促反應(yīng)
發(fā)布時間:2023/12/12 8:59:24 已瀏覽次數(shù): 96 次

 二糖酶測試盒的酶促反應(yīng)

(測麥芽糖酶)

一、測定原理:

麥芽糖酶(Lactase)作用于相應(yīng)的底物產(chǎn)生單糖,

該單糖在其氧化酶的作用下產(chǎn)生過氧化氫,過氧化氫同

顯色劑結(jié)合產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物,用分光光度計測定其光密

度值,從而測定出麥芽糖酶的活性。

二、試劑的組成和配制(25T100T):

試劑一:粉劑×1 瓶,10mL 稀釋液×1 瓶,無色透明液體;

28℃保存。

底物的配制:在試劑一粉劑中加入 10mL 的稀釋液,充

分溶解后,備用;28℃保存

試劑二:終止劑 5mL×1 瓶,28℃保存。

試劑三:50mL 液體×1 瓶,28℃保存。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液:5.55mmol/L,液體,28℃保存。用時

按體積比 1:2 的比例加蒸餾水稀釋成

1.85mmol/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

三、操作表:

1、樣本處理:

①、液體樣本:直接測定,如超過線性范圍用生理鹽

水稀釋后測定。

②、組織樣本:準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g):體積

(mL)=19 的比例,加入 9 倍體積的勻漿介質(zhì),

冰水浴條件下機(jī)械勻漿,2500 轉(zhuǎn)/,離心 10 分鐘,

取上清液待測。[]:勻漿介質(zhì)可用磷酸鹽緩沖液

(0.1mol/L pH 7.4)或生理鹽水(0.9%);

③、細(xì)胞樣本:

A、細(xì)胞收集:將制備好的細(xì)胞懸液取出,1000

轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,棄上清液,留細(xì)胞沉淀;

用等滲緩沖液(推薦 0.1mol/L 、pH77.4

酸鹽緩沖液)清洗 12 次,同樣 1000 轉(zhuǎn)/分,

離心 10 分鐘,棄上清液,留細(xì)胞沉淀;

B、細(xì)胞破碎:加入 0.20.3mL 的勻漿介質(zhì)(推

0.1mol/L pH77.4 磷酸鹽緩沖液或生理

鹽水)進(jìn)行勻漿,冰水浴條件下超聲破碎(

:300W,35 /,間隔 30 秒,重復(fù) 35

)或手動勻漿,制備好的勻漿液不離心直接

。 (

TritonX-100,12%,裂解 3040 分鐘),裂解

好的液體不離心直接測定。[]:建議細(xì)胞密

度在 100 萬個/mL 以上。破碎好的液體可顯

微鏡觀察細(xì)胞是否破碎完全。

2、酶促反應(yīng):(可用離心管操作)

 

 

[]:在做正式實驗前,先要取個別樣本(可以挑選正常組一

個和模型組一個)進(jìn)行濃度梯度預(yù)試(稀釋倍數(shù)可選 5

倍、10 倍、20 倍或其它),以確定最佳取樣濃度(最佳

濃度時,測定 OD-對照 OD 接近標(biāo)準(zhǔn) OD 即可;當(dāng)然,

樣本本身酶活力偏低時,直接原液測定甚至可以加大酶

促反應(yīng)取樣量或延長酶促反應(yīng)時間)。

四、計算公式:

1、液體樣本計算:

單位定義: 37PH6.0 的條件下,每毫升樣本每分鐘

水解 1nmol 麥芽糖定義為 1 個酶活力單位。

計算公式:

 

 二糖酶測試盒的酶促反應(yīng)

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