原位雜交樣本送樣要求 1、切片前處理要求 新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片;或取2mm左右厚度的新鮮組織,5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,4℃低溫保存運(yùn)輸,切勿冷凍結(jié)冰;盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),固定時(shí)間過長(zhǎng)影響核酸檢出率; 冰凍切片-20℃運(yùn)輸; 石蠟切片常溫運(yùn)輸; 4、 細(xì)胞爬片 細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,換無酶PBS,密封,4℃運(yùn)輸。
2、冰凍切片
3、石蠟切片
石蠟切片 熒光原位雜交 實(shí)驗(yàn)流程
下面以石蠟切片熒光原位雜交為例來具體介紹一下原位雜交的實(shí)驗(yàn)流程(具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化)。
1 石蠟切片脫蠟至水 依次將切片放入環(huán)保型脫蠟透明液Ⅰ(貨號(hào)G1128,15 min)-環(huán)保型脫蠟透明液Ⅱ(貨號(hào)G1128,15 min)-無水乙醇Ⅰ(5 min)-無水乙醇Ⅱ(5 min)-85%酒精(5 min)-75%酒精(5 min)-無酶水(貨號(hào):G4700)。 2 修復(fù) 組織切片浸沒于1×修復(fù)液(貨號(hào):G1202)中,加熱修復(fù)(如用微波爐加熱,可中火7分鐘,;7分鐘,中低火6分鐘)。 3 消化 組化筆畫圈,將蛋白酶K稀釋至20μg/mL滴加到組織上,再放入恒溫箱40℃消化20-30min,接著用無核酸酶PBS緩沖液洗3次,每次5min(最優(yōu)消化條件需根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整,以獲得最佳實(shí)驗(yàn)效果)。 4 預(yù)雜交 輕輕甩干切片,滴加40℃預(yù)熱的雜交液覆蓋組織,放入恒溫箱40℃孵育30 min。 5 雜交1 倒掉雜交液,滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物1雜交液,水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃孵育3h。(注意防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同靶標(biāo)的探針混合物1進(jìn)行雜交。賽維爾生物提供探針合成服務(wù)) 6 雜交后洗滌 倒掉雜交液,將切片依次用40℃預(yù)熱的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC(20×SSC緩沖液,貨號(hào):G3015,用無核酸酶水稀釋)各漂洗5 min(如非特異性雜交體較多,可以在此步增加洗滌時(shí)間、次數(shù)及調(diào)整雜交液中甲酰胺濃度)。 7 雜交2 輕輕甩干切片,滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物2雜交液,水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min(此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC,防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同靶標(biāo)的探針混合物2進(jìn)行雜交)。 8 雜交后洗滌 同第6步 9 信號(hào)雜交 輕輕甩干切片,滴加60 μL 40℃預(yù)熱的信號(hào)探針雜交液,水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min(此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC,防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同信號(hào)探針進(jìn)行雜交)。 10 雜交后洗滌 同第6步
根據(jù)不同的信號(hào)探針,選用不同的顯色系統(tǒng),本次是熒光探針,所以進(jìn)行DAPI染色:
11 DAPI染核 切片用無核酸酶的PBS緩沖液潤(rùn)洗,切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染色試劑(貨號(hào):G1012),避光室溫孵育8 min。 12 封片 切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 13 圖像采集分析 最后進(jìn)行鏡檢拍照,或熒光共聚焦拍照(可選),或切片掃描(可選)。 信帆生物:原位雜交實(shí)驗(yàn)樣本送樣要求 信帆生物:原位雜交實(shí)驗(yàn)樣本送樣要求
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