1、切片前處理要求

新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰；盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，固定時(shí)間過長(zhǎng)影響核酸檢出率；
2、冰凍切片

冰凍切片-20℃運(yùn)輸；
3、石蠟切片

石蠟切片常溫運(yùn)輸；

4、 細(xì)胞爬片

細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運(yùn)輸。

依次將切片放入環(huán)保型脫蠟透明液Ⅰ（貨號(hào)G1128，15 min）-環(huán)保型脫蠟透明液Ⅱ（貨號(hào)G1128，15 min）-無水乙醇Ⅰ（5 min）-無水乙醇Ⅱ（5 min）-85%酒精（5 min）-75%酒精（5 min）-無酶水(貨號(hào)：G4700)。

組織切片浸沒于1×修復(fù)液（貨號(hào)：G1202）中，加熱修復(fù)（如用微波爐加熱，可中火7分鐘，�；�7分鐘，中低火6分鐘）。

組化筆畫圈，將蛋白酶K稀釋至20μg/mL滴加到組織上，再放入恒溫箱40℃消化20-30min，接著用無核酸酶PBS緩沖液洗3次，每次5min（最優(yōu)消化條件需根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，以獲得最佳實(shí)驗(yàn)效果）。

輕輕甩干切片，滴加40℃預(yù)熱的雜交液覆蓋組織，放入恒溫箱40℃孵育30 min。

倒掉雜交液，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物1雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃孵育3h。（注意防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同靶標(biāo)的探針混合物1進(jìn)行雜交。賽維爾生物提供探針合成服務(wù)）

倒掉雜交液，將切片依次用40℃預(yù)熱的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC（20×SSC緩沖液，貨號(hào)：G3015，用無核酸酶水稀釋）各漂洗5 min（如非特異性雜交體較多，可以在此步增加洗滌時(shí)間、次數(shù)及調(diào)整雜交液中甲酰胺濃度）。

輕輕甩干切片，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物2雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min（此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC，防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同靶標(biāo)的探針混合物2進(jìn)行雜交）。

同第6步

輕輕甩干切片，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的信號(hào)探針雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min（此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC，防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同信號(hào)探針進(jìn)行雜交）。

同第6步

切片用無核酸酶的PBS緩沖液潤(rùn)洗，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染色試劑（貨號(hào)：G1012），避光室溫孵育8 min。

切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

最后進(jìn)行鏡檢拍照，或熒光共聚焦拍照（可選），或切片掃描（可選）。 信帆生物：原位雜交實(shí)驗(yàn)樣本送樣要求 信帆生物：原位雜交實(shí)驗(yàn)樣本送樣要求