原位雜交的實(shí)驗(yàn)操作步驟您清楚嗎？

信帆生物提供原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)服務(wù)。操作步驟如下：

1.組織固定：組織取出PBS漂洗后立即放入原位雜交固定液（動(dòng)物）中固定12h以上，4°保存運(yùn)輸。

2.脫水：固定后在通風(fēng)櫥內(nèi)切取目的區(qū)域組織塊約3mm厚，放入15%蔗糖溶液中8h，后換30%蔗糖溶液中過夜。

3.冰凍切片固定：冰凍切片室溫晾干，置于原位雜交固定液（動(dòng)物）固定10min，于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4.修復(fù)及消化：根據(jù)組織類型，固定時(shí)間長(zhǎng)短及指標(biāo)的定位，選用不同的修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)，具體修復(fù)條件見上表。自然冷卻后組化筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化，消化時(shí)間見上表。純水沖洗后PBS洗3次，每次5min。

5.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

6.預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

7.雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱雜交過夜。雜交條件見上表。

8.雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

9. 滴加對(duì)應(yīng)的分支探針雜交：輕輕甩干切片，滴加已預(yù)熱的相應(yīng)的分支探針雜交液(見上表及附表)（60 μL），水平置于濕盒內(nèi)40℃雜交45 min。此過程中在濕盒底部加入50ml 2× SSC，防止干片。

10.雜交后洗滌：傾去雜交液，將切片依次用40°C預(yù)熱的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC于40°C漂洗5 min。注：若非特異性雜交體較多，可以在此步增加洗滌時(shí)間、次數(shù)及調(diào)整雜交液中甲酰胺濃度。

11. 滴加對(duì)應(yīng)的信號(hào)探針：滴加含信號(hào)探針（見上表及附表）雜交液，稀釋比1：400.42°孵育3h。后依次經(jīng)過以下SSC洗滌：2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC 37°洗10min。

12.血清封閉：滴加封閉血清正常兔血清 室溫孵育30min。

13. 孵育HRP標(biāo)記鼠抗地高辛抗體（HRP-anti-DIG ）：傾去血清封閉液，滴加HRP- anti-DIG。37°孵育50min，后PBS洗5min  4次。

14.DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

15.復(fù)染細(xì)胞核：蘇木素染液復(fù)染3min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)1min，流水沖洗。

16.脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，封片劑封片。

　結(jié)果判讀：

　　陽性為棕黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色。

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，固定時(shí)間過長(zhǎng)影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運(yùn)輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運(yùn)輸；

4、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運(yùn)輸。

原位雜交的實(shí)驗(yàn)操作步驟您清楚嗎？