WB實驗代測的實驗流程

蛋白質免疫印跡法 (Western Blot ) ，簡稱WB ，是指通過SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質分離開，然后將目標蛋白轉移到載體(PVDF)膜上，利用抗原抗體的特異性結合，用特異性的一抗結合目標蛋白，用HRP標記的二抗結合一抗，再加以ECL發(fā)光液顯色，檢測組織或者細胞內某種或者某些特異性蛋白質的表達。蛋白質免疫印跡是做蛋白質分析的一種常規(guī)技術，常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析，還可以用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用后續(xù)分析。

　實驗流程：

　　蛋白提取-制膠-電泳-轉膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-化學發(fā)光-結果分析;

送樣運輸要求：

　　新鮮組織，100mg以上，干冰運輸。

　　細胞量為5*10^6以上，收集細胞沉淀，干冰運輸。

折疊試劑準備

1、SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。

2、勻漿緩沖液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巰基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

3、轉膜緩沖液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液:考馬斯亮蘭 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉，現(xiàn)配):脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、顯色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H202 1.0μl。

WB實驗代測的實驗流程