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WB實驗代測的實驗流程
發(fā)布時間:2023/10/7 10:39:57 已瀏覽次數: 106 次

WB實驗代測的實驗流程

蛋白質免疫印跡法 (Western Blot ) ,簡稱WB ,是指通過SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質分離開,然后將目標蛋白轉移到載體(PVDF)膜上,利用抗原抗體的特異性結合,用特異性的一抗結合目標蛋白,用HRP標記的二抗結合一抗,再加以ECL發(fā)光液顯色,檢測組織或者細胞內某種或者某些特異性蛋白質的表達。蛋白質免疫印跡是做蛋白質分析的一種常規(guī)技術,常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析,還可以用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用后續(xù)分析。

 實驗流程:

 

  蛋白提取-制膠-電泳-轉膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-化學發(fā)光-結果分析;

送樣運輸要求:

  新鮮組織,100mg以上,干冰運輸。

  細胞量為5*10^6以上,收集細胞沉淀,干冰運輸。

折疊試劑準備

1、SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。


2、勻漿緩沖液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巰基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。


3、轉膜緩沖液:甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。


4、0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。


5、膜染色液:考馬斯亮蘭 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉,現(xiàn)配):脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。


6、顯色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H202 1.0μl。

 

WB實驗代測的實驗流程

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