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免疫熒光:同源雙標(biāo)和異源雙標(biāo)有什么區(qū)別
發(fā)布時間:2023/10/7 10:34:04 已瀏覽次數(shù): 551 次

 免疫熒光:同源雙標(biāo)和異源雙標(biāo)有什么區(qū)別

 

異源雙標(biāo):

1、 石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復(fù):組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH8.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。中火8min至沸,停火8min,轉(zhuǎn)中低火7min,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定)

3、 畫圈:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)

4、 血清封閉:在圈內(nèi)滴加BSA孵育30min。(一抗若是山羊來源,則加驢血清)

5、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,兩種一抗按一定的稀釋比例混合,滴加到組織上,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

6、 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬標(biāo)記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。(兩種二抗,按照一定的比例混合孵育)

7、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核:切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。

8、 自發(fā)熒光淬滅:切片稍甩干后,在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,流水沖洗10min。

9、 封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照:切片置于掃描儀下采集圖像。(DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm,發(fā)藍(lán)光;FITC激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nm,發(fā)綠光;CY3激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm,發(fā)紅光. CY5激發(fā)波長 608-648nm, 發(fā)射波長672-712。 DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色,陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光,綠光 。

  同源雙標(biāo):

1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復(fù):組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH8.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。中火8min;8min轉(zhuǎn)中低火7min,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定)

3、 畫圈,雙氧水封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),切片放入3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min,封閉內(nèi)源性的過氧化物酶,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min

4、 血清封閉: 甩干PBS, 滴加BSA,封閉30min。(一抗是山羊來源用10%兔血清封閉,一抗其它來源的用3%BSA封閉)

5 、加第一種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

6 、加對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。

7 、加CY3-TSA(或FITC-TSA):玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加TSA,避光室溫孵育10min. 孵育完后,玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min

8 、微波處理:組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH8.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理,中火8min;8min轉(zhuǎn)中低火7min,去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。

9、 加第二種一抗:在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。

10、 加對應(yīng)的二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。

11、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核:切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。

12、 自發(fā)熒光淬滅:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后,在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,流水沖洗10min。

13 、封片:切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

14 、鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm,發(fā)藍(lán)光;FITC激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nm,發(fā)綠光;CY3激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm,發(fā)紅光.

同源雙標(biāo)技術(shù)原理介紹:

主要原理是基于酪胺信號放大(TSA,Tyramide signal amplification),以下簡稱TSA技術(shù)。TSA是一種基于辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野罚街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪氨酸殘基上。此結(jié)合是共價結(jié)合,而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合,通過微波修復(fù)處理,第一輪的一抗二抗被洗脫,熒光標(biāo)記的酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍。在檢測第二個靶標(biāo)時,相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記,無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需變化不同熒光標(biāo)記即可實現(xiàn)多個靶標(biāo)的標(biāo)記。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記,使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)或多重熒光染色

 

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