Polybrene /聚凝胺 使用操作說(shuō)明

產(chǎn)品名稱：Polybrene (Hexadimethrine Bromide)

中文名稱：聚凝胺

CAS號(hào)：28728-55-4

分子量：544.43

純度：≥94%

濃度：10mg/ml

Polybrene(聚凝胺)是一類高價(jià)離子季銨鹽多聚物.溶解后帶正電.與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合,能顯著提高逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率。一般能是高感染效率2～10倍。Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染。但Polybrene對(duì)某些細(xì)胞也是存在毒性的,因此.使用之前要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。

聚凝胺又名Hexadime thrine Bromide .中文名海(地)美溴鈸,是海(地)美溴銨( Hexadimethrine Bromide )液體制品的商標(biāo)名.是種非常有效的基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。用于病毒介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用濃度為8μg/ml .具體濃度依細(xì)胞類型會(huì)有差異.可參閱文獻(xiàn)或梯度實(shí)驗(yàn)摸索。Polybrene用于轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，已經(jīng)成為全球各大實(shí)驗(yàn)室和各種基因轉(zhuǎn)染服務(wù)機(jī)構(gòu)最通用的方法之一 , 相比于硫酸魚(yú)精蛋白( Protamine sulfate , CAS : 98001-69-5 )和其他陽(yáng)離子的使用普遍率更高更廣泛。

使用說(shuō)明：

實(shí)驗(yàn)1:逆轉(zhuǎn)錄病毒感染( Retroviral Infection)

(1)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的制備:取5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基(5%血清)加入約含單層轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞的100mm培養(yǎng)盤(pán)內(nèi)。孵育24h后，吸去培養(yǎng)液并用0.45um濾器過(guò)濾。

(2)待感染細(xì)胞的培養(yǎng):100mm培養(yǎng)盤(pán)內(nèi)加入10ml完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為5x105/盤(pán)。

(3)病毒感染:細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去完全培養(yǎng)液。用含polybrene的2m|病毒上清( 或?qū)⒉《驹�液稀釋�?ml)感染細(xì)胞，polybrene的終濃度 為5 Hg-10 u g/ml。37℃孵育3-6h。

(4) 收集病毒顆粒:加入8ml完全培養(yǎng)基。感染3天后，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)2:轉(zhuǎn)染

(1)完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞密度約50%;

(2)孵育細(xì)胞18-24h后準(zhǔn)備DNA-培養(yǎng)基Polybrene混合液，按如下操作制備混合液:①添加完全培養(yǎng)基(60mm培養(yǎng)M2ml，100mm培養(yǎng)皿3ml )

37℃預(yù)熱;②添加10ng～10μg質(zhì)粒輕輕混勻;③加入Polybrene至終濃度為5ug-10 H.g/mlo輕輕混勻。以上每個(gè)成分需要按順序加入。

(3)去除培養(yǎng)基，在細(xì)胞中加入DNA-培養(yǎng)基Polybrene溶液，在37° C孵育細(xì)胞620h。細(xì)胞培養(yǎng)的6h內(nèi)約每1.5h輕柔混勻。

(4)去除DNA-培養(yǎng)基Polybrene溶液。用DMSO shock solution (15%DMSO in 1X HBSS )輕輕蓋住細(xì)胞(60mm培養(yǎng)

(5)立即去除DMSOshocksolution，用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞2次。對(duì)于60mm培養(yǎng)皿每次用5ml培養(yǎng)液清洗，100mm培養(yǎng)皿每次用10ml培

養(yǎng)液清洗。皿3ml，100mm培養(yǎng)皿4ml)。每次加入溶液時(shí)用手輕晃培養(yǎng)盤(pán)10s，使得夜體均勻分布。然后37℃孵育細(xì)胞4min。

(6)加入完全培養(yǎng)基到細(xì)胞中;

(7)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化:去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，按照1 :5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。瞬時(shí)表達(dá):去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。24-72h后收獲細(xì)

注意事項(xiàng)：

1、為避免反復(fù)凍融，收到本產(chǎn)品或本產(chǎn)品配制成溶液后建議適當(dāng)分裝后-20℃保存。

2、因?yàn)镻olybrene對(duì)某些細(xì)胞可能有一定的毒性，而且Polybrene長(zhǎng)時(shí)間作用(大于12小時(shí))也可能對(duì)某些細(xì)胞產(chǎn)生毒性，所以初次使用Polybrene處理細(xì)胞，建議先做毒性測(cè)試。

3、本產(chǎn)品可能對(duì)人體有一定的毒害作用，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)，以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

4、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5、本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用，不做其它用途！